【视频】| 实验入门第七讲——免疫组化技术 科研小白-医学院
前Lead言
各位科研小白们，今天给大家介绍一种常见的免疫学技术-----免疫组化，它是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合，再通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，并对其进行定位、定性及相对定量的研究，也称免疫组织化学技术。
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
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●实验原理●
简单来说，主要根据抗原抗体反应和化学显色原理。
大家都知道，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性顾心怡，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原，制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大。
由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来。通过抗原抗体反应及呈色反应，细胞或组织中的化学成分得到显示，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
2●分类●【按标记物质的种类分】
免疫荧光法：荧光染料
放射免疫法：放射性同位素
免疫酶标法：HRP（辣根过氧化物酶）
免疫金银法：胶体金【按结合方式分】
抗原-抗体结合：如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；
亲和连接：如亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法；
聚合物链接：此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测
3●常用标记物●【荧光素】
最常用的是异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）——荧光显微镜下呈绿色荧光；四乙基罗达明（rho—damine RB200）——荧光显微镜下发橙红色荧光。【酶】
辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶【生物素】
【铁蛋白金】
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●实验步骤●
像前文提到的那样，免疫组化方法众多，在这我们以SP法为例，对其实验步骤进行简单介绍：
【1.石蜡切片制作】
取组织PBS冲洗，4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定12h。蒸馏水冲洗3次，50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水。1:1无水酒精二甲苯45min，二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）各处理30min。然后浸入石蜡包埋，1:1二甲苯石蜡（58℃）45min，石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）2.5h，用石蜡（Ⅲ）包埋组织。包埋后的组织块修整后，用切片机切成5-7um的石蜡带。将组织石蜡块在温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上，最后洗片、烤片。
【2.脱蜡水化】
切片室温放置 60min。浸泡在二甲苯中10min，放入另一个装有二甲苯的染缸再泡10min。脱蜡后，将组织切片逐级放入无水乙醇、95%、85%，75%，50%的乙醇中，每次处理均为5min。后将组织切片放入纯水中，孵育5min，再转移至PBS缓冲液中孵育5min。【3.抗原修复】
用过氧化氢浸泡8min，再用超纯水清洗，以消除内源性过氧化物酶张敬豪 。然后用柠檬酸盐缓冲液在中高火加热15min，因为在制作切片的过程中要用甲醛固定，醛基和抗原决定簇反应而破坏了其结合部位，用柠檬酸盐缓冲液在中高火加热的过程中可以把这些基团破坏，修复抗原沈阳红番区，注意柠檬酸盐缓冲液要加满，防止因为挥发而使得组织暴露在空气中干掉。在室温自然冷却。反复2次，最后用PBS冲洗。【4.免疫反应】
用滤纸擦去周围多余的PBS，滴加PBS稀释好的10%山羊血清，室温湿盒封闭30-60min。孵育结束后，去除封闭液，滴加一抗4℃孵育过夜画中欢。第二天移去一抗后，用PBS冲洗。擦去切片周围多余的液体，滴加二抗三脚金蟾 ，室温孵育30min。弃去二抗马恩岛猫，PBS洗两次69圣战事件，每次10min。【5.化学染色】
据试剂盒说明配制DAB染液，染色，显微镜下观察终止染色，记录显色时间叹为观止造句。染色结束后，PBS浸泡洗去DAB染液，每次5min，单竞缇重复3次。去除残留液体，苏木素复染2-5min，复染结束后，用水洗去多余染液，在1%盐酸酒精中浸泡数秒。最后再次水洗宫锁玉心 。
【6.脱水封片】
此过程与复水相反，50%乙醇处理5min后，依次浸泡在75%，85%，95%和无水乙醇中，每次浸泡时间为5min，最后置于二甲苯中进行透明化处理两次，每次均为10min魔岩山传说。脱水处理后，擦去切片周围的液体，滴上1滴中性树胶，盖上盖玻片封片。刘德华2013湖南跨年【7.观察分析】
显微镜下观察实验结果，拍照，实验结果分析。
Tips
组织脱水必须彻底干净庶子归来，组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程寿光民生网。如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全车奉朝，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整等。
切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原。
应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无气泡，无皱褶，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。
免疫组织化学操作由于试剂（如缓冲液、显色液、封闭液等）时间、温度的不同会出现不同的结果，影响结果的分析，每批实验标本应一次性操作完毕，否则会失去每组（实验组别）之间的可比性。
从滴加一抗以后每个步骤切片均不能干涸，否则会出现假阳性或整张切片均呈阳性色。有些抗体，修复抗原时间不宜过度，否则也会出现假阳性，如存在胞浆内的抗原在核内出现阳性表达，或定位于核内的蛋白会出现胞浆阳性。
如果你想快速了解免疫组化的步骤，请看下面的小视频吧！
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排版：孙延硕
供稿：转化医学研究院
审核：王安庐